蛍光タンパク質の各種変異体を用いた生命系学生実験教材の開発

書誌情報：広島工業大学紀要. 教育編　巻 19, p. 61-69, 発行日 2020-02

正式なPDFファイルは https://it-hiroshima.repo.nii.ac.jp/records/453 から取得可能です。

英語版とプラスミドの塩基配列ファイルは https://doi.org/10.5281/zenodo.18794565 から取得可能です。

中井　忠志

広島工業大学生命学部食品生命科学科

（令和元年10月31日受付）

Development of a Fluorescent Protein-based Laboratory Course for Life Science Students

Tadashi NAKAI

（Received Oct. 31, 2019）

概要

　DNAからタンパク質への遺伝情報の流れは生命系の学生にとって重要で基礎的な学修内容であるが，深い学びのためには学生実験でDNAとその産物のタンパク質をともに細胞から抽出・精製し，それらの性質を調べるといった実習が望まれる．しかし，学生実験では１つのテーマに割ける時間は限られているので，短期間でそれらの関連分野をまとめて学修できる内容を検討した．その結果，緑，赤，藍，橙の4色の蛍光タンパク質（それぞれ，GFP，RFP，CFP，OFP）の各遺伝子を大腸菌に導入し，少量の培養液から各蛍光タンパク質を精製できる系を開発した．構築したプラスミドは，高コピーの複製起点とアンピシリン耐性遺伝子をもち，ポリヒスチジンタグを融合させた各蛍光タンパク質の高発現を可能とする．各蛍光タンパク質を発現した大腸菌はいずれも明瞭な色を呈し，Niアフィニティカラムにより容易に発現タンパク質を精製できる．

Key Words: fluorescent protein, protein expression, protein purification, GFP mutant

1. はじめに

　大学の生命系学部でもっとも重要で基礎的な学修内容の一つとしてセントラルドグマがあげられる．DNAの遺伝情報に基づいてタンパク質が細胞内で生合成されるという流れやその仕組みは大学の授業科目でも初期に学ぶ内容であるが，学生実験においてもその分野に対応するテーマを扱うことにより，より理解が深まることが期待できる．また，この分野は遺伝子組換えによるタンパク質の生産というバイオテクノロジーによる物質生産の重要なテーマであるため，工業的応用という意味でも実践的な学びが期待される．本学では2020年にカリキュラム改訂を行うが，その機会に食品生命科学科の学生実験の1テーマとしてDNAからタンパク質，遺伝子型と表現型の分野の実験内容を再検討し，学生実験教材の開発を進めることとした．その際には以下の条件を設定した．

• 主要な生体分子として遺伝子（DNA）とタンパク質の両方を物質として取り扱う．
• 遺伝子型と表現型を簡単に観察できる．
• DNAとタンパク質を精製し，電気泳動で検出する．

これらの条件を満たすものとして，発現タンパク質自体が色をもち，目視で観察が可能な蛍光タンパク質やそれらの各種変異体が有用であると考え，学生実験で扱いやすいプラスミドの構築と実験プログラムの検討を行った．

　緑色蛍光タンパク質（GFP; green fluorescent protein）は，最初に単離された蛍光タンパク質で，野生型では238アミノ酸残基から構成される(1)．GFPの由来はオワンクラゲAequorea victoriaであり，1962年に下村脩によりタンパク質が単離された(2)．その後，1992年にDouglas Prasherにより全長の遺伝子がクローン化され(1)，1994年にMartin Chalfieにより細菌や線虫で発現させても蛍光を示すことが証明された(3)．このことは，蛍光をもつために外来の基質や他の遺伝子が不要であること意味しており，その後は急速にGFPを利用した研究が拡大した(4)．

　GFPは11本のβストランドからなる樽形のβバレル構造をもち，その内部を通るポリペプチド鎖に位置する3アミノ酸残基（Ser65, Tyr66, Gly67）が発色団を自己触媒的に形成することで蛍光を示す．Roger Y. Tsienらは，GFP遺伝子のクローン化の直後から変異導入を開始し，1994年に青，藍，黄の蛍光タンパク質（それぞれ，blue, cyan, yellowの頭文字とり，BFP，CFP，YFPと略される）を作製するとともに(5)，1996年にRemingtonらとGFPの結晶構造を決定し(6)，発色団の構造と機能の関係を明らかにした．2008年には下村，Chalfie，Tsienの3氏にノーベル化学賞が授与された．

　蛍光タンパク質の色はGFPやその変異体により青，緑，黄が初期に開発されたが，赤などの黄よりも長波長の蛍光タンパク質をGFPの変異により作り出すことは困難であった(4)．赤色蛍光タンパク質（RFP; red fluorescent protein）としては，1999年にサンゴ類に属するイソギンチャクの一種Discosoma striataからDsRedが単離され，遺伝子がクローン化された(7)．DsRedは低いながらもGFPと相同性をもち（アミノ酸配列上は19%が同一残基），その立体構造もGFPに類似したβバレル構造をもつ．DsRedの野生型は四量体で存在するため，融合タンパク質として用いるには扱いづらいという欠点があったが，変異導入により単量体化したmRFP1が開発された．その後，赤付近に他の蛍光色をもつmRFP1変異体（orange fluorescent protein (OFP)であるmOrangeをはじめ，mCherry，mStrawberryなど蛍光波長が異なるもの）が開発された．GFPやmRFP1の誘導体である様々な蛍光タンパク質は，生物系の研究で広く用いられており，現在それらの融合タンパク質は，遺伝子発現やタンパク質の局在マーカーとして多方面で利用されている．

　GFPを用いた学生実験用の教材としては，バイオラッド社の製品であるpGLOプラスミドが知られている．pGLOは，GFP遺伝子，アンピシリン（Ap）耐性遺伝子，araC遺伝子，ColE1複製起点を含む5,371 bpのプラスミドである．GFP遺伝子の上流にはアラビノースオペロンのプロモーター（P_BAD）が配置され，pGLOで形質転換した大腸菌はアラビノースを含む培地で培養することでGFPを発現し，アラビノースを含まない培地ではGFPが発現しないため，原核生物での遺伝子発現調節を学ぶためにも有用である．一方，pGLO はcycle-3 GFP (8)という改良型の変異型遺伝子をもつが，それより高性能なEGFP (9)がもつF64LとS65Tの変異（成熟が早く輝度が高い特長をもたらす）がcycle-3 GFPには含まれない．また，組み換え型タンパク質の精製において現在主流の方法ではアフィニティタグを用いて少ないステップで高純度に精製するが，pGLOのGFPにはそのようなタグが付加されておらず疎水性カラムクロマトグラフィー等で精製することが想定されている．そのため，pGLOを用いて純度の高い精製タンパク質を得るためには複数の種類のカラムクロマトグラフィーが必要であるという欠点が存在する．

　既報のGFPの精製を題材とした教育プログラムとしては，ポリヒスチジンタグ（H₆タグ）融合GFPタンパク質を用いて，ニッケル（Ni）アフィニティクロマトグラフィーで精製を行うという内容が東京薬科大学の玉腰により報告されている(10)．そこでは，タンパク質の高発現のために幅広く用いられているpET系発現プラスミドと宿主として大腸菌BL21(DE3)を用いてGFPを生産し，Ni-NTA樹脂を用いてアフィニティ精製が行われている．用いたGFPの変異についての記述はないので，その安定性や輝度については不明である．一方，プラスミドを調製する場合にはタンパク質発現用の上記大腸菌とは異なる遺伝子操作用の株（例えば，JM109やDH5αなど）を通常用いる．また，pETプラスミドを用いた場合には，pUCプラスミドの1割程度のプラスミドDNAの収量となり，収率が低いことも初心者には不利となる．したがって，実習内で発現タンパク質だけでなくプラスミドDNAの精製も行う場合には，時間の制約を考慮すると同一の大腸菌株を用い，収量の高いpUCなどの高コピーのプラスミドベクターの使用が望まれる．

　本研究では，新しいカリキュラム内の学生実験で用いる実験教材として，限られた実習時間の中で効率よく手法を学ぶために，以下の2つの条件を満たすGFP発現系の開発を試みた．（１）蛍光タンパク質の発現プラスミドDNAと発現した蛍光タンパク質そのものを，同じ大腸菌株を宿主として大量に生産できる．（２）Niキレートアフィニティークロマトグラフィーにより，一段階で蛍光タンパクの高純度精製ができる．一方，これまでの蛍光タンパク質研究の進歩により，様々な特長をもつ蛍光タンパク質変異体が報告されている．その中には，より高い安定性をもち扱いやすく，より蛍光強度が高く，緑以外にも幅広い色を示すものなど多くの報告がなされている(4)．そこで，本研究では，種々の既知の蛍光タンパク質から4種類のアミノ酸配列情報を利用して，上にあげた条件を満たす発現系の構築を試みた．その結果，すべての条件を満たす実験系を開発できたので報告する．

2. 実験方法

2.1. 実験材料

　プラスミドの構築およびタンパク質の発現には大腸菌JM109株のコンピテントセル（ECOS Competent E. coli JM109, ニッポンジーン）を使用した．大腸菌の培養はLB 培地（液体培地の組成は1.0%トリプトン，0.5%酵母エキス，0.5%塩化ナトリウムを用い，固形培地ではさらに1.5%寒天を加えた）を用い，好気性条件下，37℃で行った．プラスミドの形質転換体の培養では，各プラスミド内の薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質を以下の終濃度になるよう培地に加えた．50 µg/mL Ap，30 µg/mL ストレプトマイシン（Sm）．

　カルボキシ末端（C末端）にH₆タグを付加したタンパク質の発現プラスミドを作製するため，C末端H₆タグ融合sQhpCタンパク質の発現プラスミド（pBBR-sQhpC-H₆）(11)を骨格として使用した．このプラスミドは，T7プロモーター下流のNdeI/BamHI部位にsQhpC遺伝子，NheI部位，６個のHisコドン，終止コドンをその順序で挿入したものである．その中のNdeI/NheI部位に目的遺伝子を挿入することで，C末端側にアミノ酸配列ASHHHHHH（ASはNheI部位の6塩基に対応）が付加されたタンパク質が発現できる．制限酵素はすべてNew England Biolabs Japanの製品を用い，NdeIを除いてハイフィデリティー（HF）版を使用した．PCRに用いたプライマーの配列を表1に示した．

図1　プラスミドpUC-GFP-H₆の模式図

2.2. 蛍光タンパク質発現プラスミドの構築

　構築した４種類のプラスミドを代表してpUC-GFP-H₆の模式図を図1に示した．その他のプラスミド（pUC-RFP-H₆，pUC-CFP-H₆，pUC-OFP-H₆）については，pUC-GFP-H₆のGFP遺伝子（NdeI/NheI間の703 bp）をその他の蛍光タンパク質遺伝子で置換することにより構築した．いずれの蛍光タンパク質遺伝子も化学合成した人工遺伝子を用い，N末端側にNdeI，C末端側にNheIの制限酵素部位を配置した（表2）．また，大腸菌において発現量が最大になるように使用コドンを大腸菌にあわせて最適化した塩基配列を使用した（表2）．

　pUC-GFP-H₆の構築方法を以下に示す．pBBR-sQhpC-H₆のpBBR1複製起点を含む領域（XbaI/PstI間の1704 bp），Sm耐性遺伝子を含む領域（SphI/EcoRV間の1373 bp），sQhpCをコードする領域（NdeI/NheI間の158 bp）を，ぞれぞれ，プラスミドpUC19のColE1複製起点を含む領域（図1のXbaI/PstI間の1056 bp，表1のプライマーP1, P2が対応），pUC19のAp耐性遺伝子を含む領域（SphI/StuI間の1245 bp，表1のプライマーP3, P4が対応），GFP遺伝子（図1のNdeI/NheI間の703 bp）で置換することにより構築した．その過程では，必要な制限酵素部位を5'末端に付加したプライマー（表1）を用い，pUC19を鋳型としてPCRにより増幅して得られた断片を制限酵素で切断した．次いで各断片をアガロースゲル電気泳動で分離し，FastGene Gel/PCR Extraction Kit（日本ジェネティクス）を用いて抽出・精製した．T4 DNAリガーゼ（DNA Ligation Kit, Mighty Mix, タカラバイオ）を用いて断片同士を接続した後，ライゲーション反応溶液を用いて形質転換した大腸菌をLB寒天培地（Ap入り）に塗布し，37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た．シングルコロニーを2 mLのLB培地（Ap入り）に移し，37℃で一晩振盪培養した．培養液を6,000 rpm，10分間の遠心分離により集菌し，菌体からのプラスミドの精製は，基本的にはアルカリ抽出法(12)にスピンカラム法を組み合わせた方法(13)に従い，FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス）を用いて行った．構築した4種類の発現プラスミドはすべてDNAシークエンシングを行い，塩基配列に意図しない変異が入っていないことを確認した．

表1　プラスミド構築に用いたプライマー

プライマー名	塩基配列a	制限酵素部位
P1	5’-GCTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAAT-3’	XbaI
P2	5’-TATACTGCAGTCATGACCAAAATCCCTTAACGTG-3’	PstI
P3	5’-TATAGCATGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3’	SphI
P4	5’-CCTTACCAATGCTTAATCAGTGAG-3’	StuI
a制限酵素部位を下線で示した．P4はStuIの制限酵素部位の半分を含む．

表2　本研究で用いた蛍光タンパク質の人工遺伝子

遺伝子名	塩基配列a
GFP	CATATGCGCA AAGGTGAAGA ACTGTTTACC GGTGTTGTTC CGATTCTGAT TGAACTGGAT GGTGATGTGA ATGGCCATAA ATTCTTTGTT CGTGGTGAAG GCGAAGGTGA TGCAACCATT GGTAAACTGA GCCTGAAATT TATCTGTACC ACCGGCAAAC TGCCGGTTCC GTGGCCGACC CTGGTTACCA CCCTGACCTA TGGTGTTCAG TGTTTTAGCC GTTATCCGGA TCACATGAAA CGCCACGATT TTTTCAAAAG CGCAATGCCG GAAGGTTATG TTCAAGAACG TACCATCTAT TTCAAAGATG ACGGCACCTA TAAAACCCGT GCCGAAGTTA AATTTGAAGG TGATACCCTG GTGAATCGCA TTGAACTGAA AGGCATCGAT TTTAAAGAAG ATGGCAATAT CCTGGGCCAC AAACTGGAAT ATAATTTTAA CAGCCACAAA GTGTACATCA CCGCAGATAA ACAGAACAAT GGCATCAAAG CCAATTTTAC CATTCGCCAT AATGTGGAAG ATGGTAGCGT GCAGCTGGCA GATCATTATC AGCAGAATAC CCCGATTGGT GATGGTCCGG TTGATCTGCC GGATGATCAC TATCTGAGCA CCCAGACCAT TCTGAGCAAA GATCTGAATG AAAAACGCGA TCACATGGTG CTGCTGGAAT ATGTTACCGC AGCAGGTATT ACCGATGCAA GCGCTAGC
RFP	CATATGGGCG AAGAGGATAA TATGGCCATC ATCAAAGAAT TTATGCGCTT TAAAGTGCAC ATGGAAGGTA GCGTTAATGG CCATGAATTT GAAATTGAAG GTGAAGGCGA AGGTCATCCG TATGAAGGCA CCCAGACCGC AAAACTGAAA GTTACCAAAG GTGGTCCGCT GCCGTTTGCA TGGGATATTC TGAGTCCGCA GTTTATGTAT GGTAGCAAAG CCTATGTTAA ACATCCGGCA GATATCCCGG ATTATCTGAA ACTGAGCTTT CCGGAAGGTT TTACCTGGGA ACGTGTTATG AATTTTGAAG ATGGTGGTGT TGTTACCGTT ACCCAGGATA GCAGCCTGCA GGATGGTGAA TTTATCTATA AAGTTAAACT GCTGGGCACC AATTTTCCGA GTGATGGTCC GGTTATGCAG AAAAAAACCA ATGGTTGGGA AGCAAGCACC GAACGTATGT ATCCGGAAGA TGGCGCACTG AAAGGTGAAA TTAATCAGCG CCTGAAACTG AAAGATGGTG GCCATTATGA TGCAGAAGTT AAAACCACCT ATAAAGCCAA AAAACCGGTT CAGCTGCCTG GTGCATATAA CGTTGATATT AAACTGGATA TCACCAGCCA CAACGAGGAT TATACCATTG TTGAACAGTA TGAACGTGCA GAAGGTCGTC ATAGCACCGG TGGTGCTAGC
CFP	CATATGTCAA AAGGCGAAGA GCTGTTTACC GGCGTAGTAC CGATTCTGGT TGAACTGGAT GGCGATGTTA ACGGCCATAA ATTCAGTGTT CGTGGCGAAG GAGAAGGTGA TGCGACTAAT GGCAAATTGA CCCTGAAATT CATCTGTACG ACGGGAAAAC TGCCTGTGCC GTGGCCTACC CTGGTGACGA CGCTTACTTG GGGTGTACAG TGCTTTTCTC GCTATCCAGA CCACATGAAA CGCCATGACT TCTTCAAAAG TGCTATGCCG GAAGGCTATG TGCAAGAACG TACCATCAGC TTTAAGGACG ATGGGACCTA CAAAACCCGT GCAGAAGTCA AGTTCGAGGG TGATACCTTA GTGAATCGCA TTGAACTGAA AGGGATTGAC TTTAAAGAAG ATGGCAATAT CTTGGGCCAT AAGCTGGAGT ACAACTTTAA CTCGCATAAC GTCTACATTA CCGCTGATAA ACAGAAGAAT GGAATCAAGG CCAACTTCAA AATCCGCCAC AACGTTGAAG ATGGTTCGGT CCAACTTGCG GATCACTATC AGCAGAATAC TCCGATTGGG GACGGTCCAG TGTTATTACC CGATAACCAC TATCTCAGCA CACAGAGCAA ACTGTCCAAA GACCCCAATG AGAAACGGGA TCACATGGTG TTGCTGGAGT TTGTGACAGC AGCGGGTATT ACGCATGGTA TGGACGAACT CTATAAAGCT AGC
OFP	CATATGGTTT CGAAAGGCGA AGAGAACAAC ATGGCGATTA TTAAGGAATT TATGCGCTTT AAAGTCCGCA TGGAAGGGAG CGTAAATGGC CATGAGTTTG AGATTGAGGG TGAAGGCGAA GGGCGTCCCT ATGAAGGCTT CCAAACCGCG AAACTGAAAG TGACGAAAGG CGGCCCATTG CCCTTTGCAT GGGATATTTT GTCACCACAG TTCACTTATG GAAGCAAAGC CTACGTGAAA CATCCGGCGG ACATTCCGGA CTATTTCAAA CTGTCGTTTC CTGAAGGGTT TAAATGGGAG CGCGTAATGA ACTTCGAAGA TGGTGGTGTT GTAACCGTGA CGCAGGACTC TAGCCTCCAG GATGGTGAGT TCATCTACAA GGTGAAATTA CGCGGCACCA ACTTTCCGTC GGATGGCCCG GTCATGCAGA AGAAAACTAT GGGTTGGGAA GCTAGTTCCG AACGCATGTA TCCGGAAGAT GGAGCCCTGA AAGGGGAGAT CAAAATGCGC TTAAAACTGA AGGACGGTGG CCACTACACC AGCGAGGTTA AGACCACGTA TAAAGCCAAG AAACCGGTTC AACTGCCTGG AGCCTATATT GTGGGTATCA AACTCGACAT CACCAGTCAC AATGAAGATT ACACGATTGT GGAACAGTAC GAACGTGCGG AAGGTCGTCA TTCAACTGGT GGCATGGATG AGCTGTACAA AGCTAGC
aセンス鎖の塩基配列（5'→3'）のみを示し，制限酵素部位（NdeI, NheI）を下線で示した．

表3　本研究で用いた蛍光タンパク質のアミノ酸配列

蛍光タンパク質名	アミノ酸配列a
GFP-H6	MRKGEELFTG VVPILIELDG DVNGHKFFVR GEGEGDATIG KLSLKFICTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTIYF KDDGTYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNFNSHKV YITADKQNNG IKANFTIRHN VEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVDLPDDHY LSTQTILSKD LNEKRDHMVL LEYVTAAGIT DASASHHHHH H
RFP-H6	MGEEDNMAII KEFMRFKVHM EGSVNGHEFE IEGEGEGHPY EGTQTAKLKV TKGGPLPFAW DILSPQFMYG SKAYVKHPAD IPDYLKLSFP EGFTWERVMN FEDGGVVTVT QDSSLQDGEF IYKVKLLGTN FPSDGPVMQK KTNGWEASTE RMYPEDGALK GEINQRLKLK DGGHYDAEVK TTYKAKKPVQ LPGAYNVDIK LDITSHNEDY TIVEQYERAE GRHSTGGASH HHHHH
CFP-H6	MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVR GEGEGDATNG KLTLKFICTT GKLPVPWPTL VTTLTWGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGTYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNFNSHNV YITADKQKNG IKANFKIRHN VEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSKLSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT HGMDELYKAS HHHHHH
OFP-H6	MVSKGEENNM AIIKEFMRFK VRMEGSVNGH EFEIEGEGEG RPYEGFQTAK LKVTKGGPLP FAWDILSPQF TYGSKAYVKH PADIPDYFKL SFPEGFKWER VMNFEDGGVV TVTQDSSLQD GEFIYKVKLR GTNFPSDGPV MQKKTMGWEA SSERMYPEDG ALKGEIKMRL KLKDGGHYTS EVKTTYKAKK PVQLPGAYIV GIKLDITSHN EDYTIVEQYE RAEGRHSTGG MDELYKASHH HHHH
a各蛍光タンパク質において発色団を構成する3アミノ酸残基（GFPのThr65, Tyr66, Gly67, RFPのMet65, Tyr66, Gly67, CFPのThr65, Trp66, Gly67, OFPのThr65, Tyr66, Gly67）を下線で示した．

2.3. 蛍光タンパク質の発現と精製

　それぞれの蛍光タンパク質発現プラスミドで大腸菌を形質転換し，LB寒天培地（Ap入り）を用いて37℃で一晩培養することでコロニーを得た．シングルコロニー1個を100 mLのLB培地（Ap入り）に移し，37℃で24時間振盪培養した．培養終了後，培養液を50 mLの遠沈管に移し，6,000 rpm，4℃，20分間の遠心分離を2回繰り返すことで，100 mLの培養液中の菌体を1本の遠沈管に沈殿として集めた．遠沈管の上澄みの培地を取り除いた後，使用するまで菌体を遠沈管内で−20℃にて冷凍保存した．

　氷上で解凍した菌体に40 mLの溶菌バッファー（10 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0），500 mM塩化ナトリウム）を加え十分に懸濁した後，超音波破砕を行い20,000×g，4℃，60分の遠心分離により上清を回収し，抽出液を得た．なお，超音波破砕では，菌懸濁液の入った遠沈管を氷上に置き，超音波破砕機Sonifier 250（Branson）を用い， output 5，duty 50%，1分破砕，1 分休止の過程を合計3回繰り返した．

　遠心後の各抽出液は，溶菌バッファーで平衡化したNiキレートカラム（ベッド体積1 mL, cOmplete His-tag purification resin, ロシュ）に吸着させた．次いで，洗浄バッファー（10 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0），500 mM塩化ナトリウム）10 mLで非特異的にカラムに結合した夾雑タンパク質を洗浄し，溶出バッファー（10 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0），500 mM塩化ナトリウムを含む，500 mMイミダゾール）で溶出した．蛍光タンパク質を含む溶出液は，いずれも特有の色をもつため目視により蛍光タンパク質を含む溶出液を試験管に分取した．各画分について，ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を行った．なお，SDS-PAGEでは，基本的にはLaemmliの方法(14)に従ったが，ゲルには市販品であるAny kDミニプロティアンTGXプレキャストゲル（バイオラッド）を用いた．泳動後のゲルはコロイドCBB染色(15)を行い，タンパク質バンドを検出した．精製タンパク質濃度の定量はBradford法(16)に従い，プロテインアッセイCBB溶液（5倍濃縮）（ナカライ）を用いて定量した．

3. 結果

3.1. 蛍光タンパク質のアミノ酸配列の選択

　本研究では蛍光波長の異なる4種類の蛍光タンパク質の人工遺伝子を用いた．使用したアミノ酸配列を表3に示した．GFPについては，高い構造安定性をもつsuperfolder (sf)型のGFP (sfGFP)をさらに改良したGFP_optのアミノ酸配列(17)を用いた．なお，GFP_optは3本のポリペプチド鎖に分割して発現させても，それらの再会合により蛍光を示す改変型GFPである(17)．RFPについては，単量体であるmCherryの高安定型のsfCherryのアミノ酸配列(18)を用いた．CFPについても，単量体であり高安定型のsfCFPのアミノ酸配列(19)を用いた．OFPについては，単量体であるmOrangeのアミノ酸配列(20)を用いた．

3.2. 形質転換体コロニーの発色とプラスミドDNAの精製

　構築した4種類の蛍光タンパク質発現プラスミドで形質転換され，LB寒天培地に生じた大腸菌コロニーは白色光では着色はわずかであり，ほぼ白色を示した．一方，プラスミドを調製するために，シングルコロニーを2 mLのLB培地に接種し37℃で一晩培養した場合には，集菌後の菌体はそれぞれに特有な色を呈していた（後述の発現時の培養液と同様の着色）．また，最初に生じた白色のシングルコロニーを，終濃度1 mMのIPTGを含むLB寒天培地に接種して一晩培養した場合には寒天培地上で強い着色がみられ，青色光を照射することで特有の蛍光色を示した（図2）．これらの2 mLの培養液から，いずれのプラスミドについても約10 µgのDNAが精製により得られた．

図2　寒天培地で培養した蛍光タンパク質発現大腸菌の写真．白色光（左）と青色光（右）を下から照射して撮影した．青色光使用時には橙色フィルターを用いた．

3.3. 蛍光タンパク質の発現と精製

　蛍光タンパク質発現プラスミドで形質転換した大腸菌をそれぞれ培養し，各蛍光タンパク質を発現させた後，集菌した（図3）．次に菌体の抽出液から，H₆タグを融合した蛍光タンパク質をNiアフィニティクロマトグラフィーにより精製した（図4）．精製タンパク質の各種条件下の写真を図5に示した．溶出画分の精製タンパク質の収量は，1回の培養液100 mLあたり，0.9 mg (GFP-H₆)，0.7 mg (RFP-H₆)，3.5 mg (CFP-H₆)，3.6 mg (OFP-H₆)であった．精製タンパク質のSDS-PAGEを行い，タンパク質バンドをCBB染色で検出したところ，いずれの蛍光タンパク質も90%以上の純度で溶出画分に存在していることが判明した（図6）．

図3　集菌前の培養液（a）と集菌後の菌体（b）の写真

図4　蛍光タンパク質のNiアフィニティカラム精製．CFPとOFPの場合についてのみ示す。精製では、Niアフィニティ樹脂をエコノパッククロマトグラフィー用カラム（#7321010, バイオラッド）に充填し、PD-10 Spin Adapter（GEヘルスケア）を用いてカラムを50 mL遠沈管に装着して精製をすすめた。

図5　精製した蛍光タンパク質の写真．白色光(a)，青色光(b)，紫外線(c)を照射して撮影した．左から，GFP-H₆, RFP-H₆, CFP-H₆, OFP-H₆の順に蛍光タンパク質の入ったマイクロチューブを配置した．

図6　蛍光タンパク質のNiアフィニティ精製．精製時の各画分についてSDS-PAGEを行った．可溶性（S），素通り（FT1, FT2），洗浄（W），溶出（E1, E2, E3）の画分について電気泳動した．溶出画分の主要なバンドがGFP-H₆（27.3 kDa）およびRFP-H₆（26.5 kDa）に対応する．

3.4. 連続5日間の実習案の作成

　半期14回の学生実験を3教員で分担するため，1教員あたり4～5回の実習内容を今後用意したいが，まずその準備として連続5日間の実習案を作成した．そこでは，一週間の集中講座で使いやすいような内容とした．

　1日目：寒天培地（IPTGの添加の有無による2種類）と液体培地（2 mL, 100 mL）の準備，蛍光タンパク質発現プラスミドによる大腸菌の形質転換，形質転換体の寒天培地への塗布．

　2日目：寒天培地の観察（IPTGの添加の有無による着色の違いを考察），シングルコロニーを1個ずつ液体培地（2 mLと100 mLの2種類）に植菌して，培養を開始．

　3日目：培養液（2 mL）からのプラスミド精製，制限酵素による切断処理，アガロースゲル電気泳動．培養液（100 mL）の遠心分離による蛍光タンパク質発現大腸菌の集菌と冷凍保存．

　4日目：菌体（前日凍結したものを解凍）の超音波破砕による発現タンパク質の抽出とNiキレートカラムクロマトグラフィーによる精製（複数の光源を利用した精製タンパク質の観察）．すべての画分を冷蔵保存．

　5日目：精製画分のSDS-PAGEとCBB染色．タンパク質バンドの解析（精製タンパク質の分子量の計算）．

4. 考察

　本研究では4種類の蛍光タンパク質（GFP-H₆，RFP-H₆，CFP-H₆，OFP-H₆）のC末端にH₆タグを融合した発現プラスミドを構築し，それぞれのタンパク質を高収量で精製できることを示した．その際に，プラスミドDNAの生産とタンパク質の発現を同じ菌株を宿主として用い，DNAとタンパク質をともに十分な収量で精製することができた．2種類の宿主を用いるpETを用いた系に比べると簡潔であり，プラスミドDNAの調製とタンパク質の精製を短期間で修得できるという点で有利な系が構築できたと考える．

　今回構築したプラスミドでも，これまでの多くの報告例と同様であるが，ラクトースプロモーターを用いてIPTGの添加により発現の誘導が可能であることが判明した．その一方で，IPTGなどの誘導物質を添加しないでも，プラスミド調製やタンパク質発現における長時間培養（一晩以上）では発現が誘導されることが判明した．これは，ラクトースプロモーター上流に存在するCAP結合部位（図1）の存在によるものと考えられる．長時間培養にともなうグルコース枯渇によりcAMPが増加し、生じたCAP-cAMP複合体がCAP結合部位に結合することで転写が活性化されたためと解釈できる．このように，誘導物質を加えなくても長時間の培養により組み換えタンパク質を高発現できるという性質は実習においても有用と考えられる．誘導物質の添加のタイミングが重要である場合，誘導のために継続した注意が必要であるし，並行して他の実験を進めることは初心者には難しいためである．一方，もう一つの利点として，今回発現に用いたラクトースプロモーターによる発現調節機構は生命系学生の必修の内容であるため，授業科目とともに本実習に参加することにより相乗効果が期待できる．既製品のpGLOによる発現調節ではアラビノースプロモーターが使われ，より正確な発現調節が可能であるという利点をもつが，分子生物学を初めて学ぶ生命系の学生にはより基本的な内容であるラクトースプロモーターの方がふさわしいと考える．

　今回開発した系の特長として次の点が挙げられる．まず，緑色だけではなく，その他の色の蛍光タンパク質も容易に精製が可能な点である．次に，いずれの蛍光タンパク質でも，コロニーや培養液のままで着色を観察でき，発現の有無を判定できる点である．また，宿主の大腸菌株としてカルタヘナ法の規制対象外のJM109株（それ自体は遺伝子組換え体でない）を利用することもあげられる．pET系を用いる場合にはBL21(DE3)株（DE3がゲノムDNAに組み込まれた遺伝子組換え体）などのカルタヘナ法の規制対象の菌株を購入する必要があるため，組織の事情等で入手が難しい場合にも本実験系なら利用が可能である．

　本研究により，いずれの蛍光タンパクとも，100 mLの培養液から0.7～3.6 mgの精製物を90%以上の純度で容易に調製できることが判明した．この程度の収量であれば，この系を用いたタンパク質の結晶化実験の実習にも用いられるかもしれない（結晶化の可否は前もって調べておく必要がある）．タンパク質の結晶が析出した際には低分子の塩の結晶と見分ける必要があるが，それ自体に色をもつ蛍光タンパク質なら容易に判別が可能である．また，その他に追加できる実習内容として，変異導入実験があげられる．蛍光タンパク質は１アミノ酸の変異により，GFPからCFP, BFP, YFPへの変換が可能であるため(5)，本系に適用することで目的の変異導入の有無をコロニーのままで蛍光色の違いにより判定できると考えられる．したがって，遺伝子型を変異導入により変化させることにより，生きた細胞のまま容易に表現型の変化を観察できることを意味し，変異導入の実習のための実験系としても本系が有用であろう．今後の課題として，本稿で示した実習案を1週間おきの学生実験にどのように調整するかをさらに検討する必要があるが，今回構築した蛍光タンパク質の発現プラスミドは上述のように応用範囲も広いため，さまざまな実習の基礎となる実験教材として有用と考える．プラスミドの入手を希望される方は筆者まで連絡していただきたい。

謝辞

　広島工業大学生命学部食品生命科学科の宮城尚弥氏，横田愛実氏，高見直樹氏，土屋響生氏，松場匠哉氏，湯場亮太氏，芳田陸氏には開発途中の教材を用いた実験練習に参加いただいた．この場を借りて感謝申し上げる．

文献

1. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J., Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein, Gene, 111, 2, 229–233 (1992).
2. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y., Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea, J. Cell. Comp. Physiol., 59, 223–39 (1962).
3. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C., Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science, 263, 5148, 802–805 (1994).
4. Day, R. N., Davidson, M. W., The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging, Chem. Soc. Rev., 38, 2887–2921 (2009).
5. Heim, R., Prasher, D. C., Tsien, R. Y., Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 91, 26, 12501–12504 (1994).
6. Ormö, M., Cubitt, A. B., Kallio, K., Gross, L. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J., Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Science, 273, 5280, 1392–1395 (1996).
7. Matz, M. V., Fradkov, A. F., Labas, Y. A., Savitsky, A. P., Zaraisky, A. G., Markelov, M. L., Lukyanov, S. A., Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species, Nat. Biotechnol., 17, 10, 969–973 (1999).
8. Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E., Stemmer, W. P., Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, Nat Biotechnol., 14, 3, 315–319 (1996).
9. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Improved green fluorescence, Nature, 373, 6516, 663–664 (1995).
10. 玉腰雅忠, 緑色蛍光タンパク質の精製を題材とした教育プログラム, 東京薬科大学研究紀要, 14, 35–41 (2011).
11. Nakai, T., Ito, H., Kobayashi, K., Takahashi, Y., Hori, H., Tsubaki, M., Tanizawa, K., Okajima, T., The radical S-adenosyl-L-methionine enzyme QhpD catalyzes sequential formation of intra-protein sulfur-to-methylene carbon thioether bonds, J. Biol. Chem., 290, 17, 11144–11166 (2015).
12. Birnboim, H. C., Doly J., A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res., 7, 6, 1513–1523 (1979).
13. 高木昌宏, いまさら聞けないプラスミド抽出法の原理, 生物工学, 89, 9, 544–548 (2011)
14. Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 5259, 680–685 (1970).
15. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J. Vis. Exp. 30, 1431 (2009).
16. Bradford, M. M. Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976).
17. Cabantous, S., Nguyen, H. B., Pedelacq, J.-D., Koraïchi, F., Chaudhary, A., Ganguly, K., Lockard, M. a, Favre, G., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S., A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association, Sci. Rep. 3, 2854 (2013).
18. Nguyen, H. B., Hung, L.-W., Yeates, T. O., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S., Split green fluorescent protein as a modular binding partner for protein crystallization, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69, 2513–2523 (2013).
19. Takacs, C. N., Kloos, Z. A., Scott, M., Rosa, P. A., Jacobs-Wagner, C., Fluorescent proteins, promoters, and selectable markers for applications in the lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi, Appl. Environ. Microbiol. 84, (2018).
20. Shaner, N. C. et al., Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein, Nat. Biotechnol. 22, 12, 1567–1572 (2004).